综述：基因组测序：技术、进展及未来路径

《Journal of Bio-X Research》：Genomic Sequencing: Techniques, Advancements, and the Path Ahead

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时间：2025年06月04日

来源：Journal of Bio-X Research

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本文系统综述基因组测序技术发展，从传统方法到下一代测序（NGS）、单分子测序等前沿技术，探讨其在基因表达分析、表观遗传、微生物组等领域应用，展望在精准医疗等方向的潜力，为相关研究提供全面技术参考。

基因组测序技术的演进与多元化应用

核心技术发展脉络

基因组测序的核心目标是确定 DNA 分子中核苷酸（腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶）的排列顺序。从早期的桑格（Sanger）测序到如今的下一代测序（NGS），技术革新显著提升了测序效率与成本效益。NGS 通过大规模平行测序（如 Illumina 的边合成边测序、Roche/454 的焦磷酸测序）实现高通量分析，可同时读取数百万 DNA 片段，大幅缩短时间并降低成本。例如，Illumina 平台通过桥式扩增在流动池生成 DNA 簇，结合荧光标记核苷酸实现碱基识别；而 PacBio 的单分子实时测序（SMRT）和牛津纳米孔（ONT）的纳米孔技术则开创了长读长时代，无需 PCR 扩增即可直接测序单个分子，PacBio 通过监测 DNA 聚合酶实时合成读取序列，ONT 则利用核苷酸通过纳米孔时的电流变化解析序列。

关键方法与技术平台

传统方法的局限与 NGS 突破传统基因表达分析如 Northern blotting、逆转录 PCR（RT-PCR）、微阵列等技术，虽能提供特定基因的表达信息，但存在通量低、动态范围有限等不足。NGS 通过 RNA 测序（RNA-seq）实现全转录组分析，可检测稀有转录本和可变剪接事件。例如，串行基因表达分析（SAGE）通过测序 mRNA 短标签量化表达，但因成本高被 NGS 取代；染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）结合 NGS，可全基因组定位 DNA - 蛋白质相互作用，如在秀丽隐杆线虫中定位核小体位置。

长读长与单分子测序的革新单分子测序技术（如 PacBio SMRT、ONT 纳米孔）无需扩增，避免了 PCR 引入的偏倚，尤其适合复杂基因组组装。PacBio 的高保真（HiFi）测序将读长延长至数万碱基对，错误率低至 1% 以下；ONT 的 PromethION 平台虽读长更长（可达兆碱基），但错误率较高（5%-15%），需通过算法校正。合成长读长测序（SLRS）结合短读长数据计算组装，如 10x Genomics 的 Linked-Read 技术，通过条形码标记保留空间信息，降低长读长成本。

新兴技术拓展研究维度

空间转录组学：如 10x Genomics 的 Visium 平台，通过空间条形码标记组织切片中的 mRNA，将基因表达与细胞空间位置关联，揭示组织特异性模式，用于胚胎发育和肿瘤微环境研究。

表观遗传测序：亚硫酸氢盐测序区分甲基化与未甲基化胞嘧啶，染色质可及性测序（ATAC-seq）利用转座酶标记开放染色质区域，解析基因调控网络。

CRISPR-Cas9 靶向测序：通过向导 RNA（gRNA）引导 Cas9 切割目标基因组区域，富集特定片段测序，提高突变检测灵敏度，应用于癌症驱动基因分析。

多领域应用与挑战

微生物组与生态研究宏基因组学直接测序环境样本中的微生物 DNA，无需培养即可揭示群落多样性。例如，人类微生物组计划通过 NGS 解析肠道菌群与健康的关系，发现微生物代谢通路与肥胖、炎症性肠病的关联；海洋和土壤宏基因组研究则助力碳循环和污染物降解机制解析。

精准医疗与临床诊断NGS 在肿瘤诊断中实现靶向治疗指导，如 FoundationOne CDx 检测实体瘤基因突变；全基因组测序（WGS）用于罕见病如囊性纤维化、脊髓性肌萎缩（SMA）的致病突变鉴定，推动基因治疗（如 Zolgensma 治疗 SMA）。数字测序（如数字 droplet PCR, ddPCR）通过单分子分区计数，实现低丰度突变（0.01%）检测，助力液态活检中循环肿瘤 DNA（ctDNA）分析。

技术瓶颈与伦理考量NGS 面临数据存储（单次运行产生 TB 级数据）、计算分析（需高性能算法组装和注释）及成本问题；长读长技术虽提升组装准确性，但通量较低。伦理方面，产前基因组筛查可能检出意义未明变异，引发妊娠决策争议；基因隐私和数据安全需通过区块链等技术保障。

未来发展方向

技术融合与性能提升第三代测序（TGS）与单细胞技术结合，如单细胞长读长 RNA 测序，解析单个细胞的转录本异质性；空间转录组与蛋白质组联合分析（如空间多组学），构建细胞状态的多维图谱。AI 驱动的碱基识别算法（如 DeepMind 的 AlphaFold 相关技术）和量子计算有望加速序列比对和结构预测。

应用场景拓展合成生物学中，长读长测序助力人工基因组设计与组装；环境监测中，宏基因组实时测序可预警病原体传播（如新冠病毒变异追踪）。随着 “$100 基因组” 目标推进，测序将更普及，推动疾病预测（如多基因风险评分）和个性化营养、用药指导。

标准化与全球协作不同平台的数据兼容性（如 Illumina 与 ONT 的混合组装）和分析流程标准化（如 Docker 容器化工具）是未来重点；全球数据库共享（如 GTEx、TCGA）需解决隐私与数据主权问题，推动跨种族基因组研究，揭示遗传多样性对疾病易感性的影响。

基因组测序技术正从 “读序列” 迈向 “解功能”，通过多技术整合与跨学科合作，终将解码生命奥秘，推动医学与生物学的革命性突破。

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